Trois R de l’expérimentation animale éthiquement acceptable

Table des matières

Objectifs

Les objectifs de ce module sont les suivants :

  • Traiter des Trois R tels qu'ils ont été définis par Russell et Burch en 1959
  • Introduire le concept d'alternatives en recherche, en enseignement et dans les tests
  • Traiter de l'applicabilité et des limites des alternatives
  • Étudier certains exemples d'alternatives et la manière dont ils peuvent être mis en pratique

Questions en guise de préface

Deux questions suggestives sont posées afin d'aiguiser la curiosité du lecteur et d'esquisser l'importance de traiter du principe des Trois R quand il s'agit d'assumer ses responsabilités éthiques dans le cadre de l'expérimentation animale appropriée.

Les questions posées ont trait à deux des aspects les plus contestés en recherche, en enseignement et dans les tests qui font appel à l'utilisation des animaux, et qui sont d'une part le nombre d'animaux utilisés et d'autre part la douleur et la détresse vécues par ces animaux. Les réponses sont présentées sous forme d'arguments en faveur de l'utilisation des animaux, en fonction de ce qui leur est fait et du nombre d'animaux utilisés. Pensez-vous que les réponses sont justifiées? Reportez-vous aux commentaires pour de plus amples explications.

Introduction

La question de la douleur et de la détresse chez les animaux utilisés en recherche, en enseignement et dans les tests préoccupe depuis longtemps le public et la communauté des chercheurs. Ajoutée à l'utilisation d'un nombre croissant d'animaux pour la recherche fondamentale et appliquée, cette préoccupation a incité W.M.S. Russell et R.L. Burch à se pencher sur les mécanismes décisionnels à mettre en place dans le cadre de l'utilisation des animaux.

Les Trois R signifient Réduction, Remplacement et Raffinement. Dans le livre The Principles of Humane Experimental Technique, publié en 1959, les auteurs Russell et Burch proposent que toute recherche faisant appel à l'utilisation d'animaux soit évaluée au regard de l'applicabilité du principe des Trois R. Ils ont reconnu que bien que le remplacement des animaux en tant que sujets de recherche était un objectif souhaitable, la science menée de manière appropriée gagnerait aussi beaucoup à la réduction des nombres d'animaux utilisés et au raffinement des procédures effectuées sur les animaux. Depuis une quarantaine d'années, le principe des Trois R est largement reconnu comme faisant partie des principes éthiques à respecter dans le cadre des sciences faisant appel à l'utilisation des animaux.

Nombre d'organismes responsables d'établir des normes pour le soin et l'utilisation des animaux en expérimentation, dont le Conseil canadien de protection des animaux (CCPA), exige des chercheurs qu'ils examinent la mise en application du Principe des Trois R lors de la conception des expériences devant faire appel à l'utilisation d'animaux. Le chercheur principal doit examiner s'il est nécessaire d'utiliser des animaux et, si tel est le cas, il se doit de considérer leur utilisation à la lumière des Trois R. Le protocole soumis au Comité de protection des animaux doit donner les raisons à l'appui de l'utilisation d'animaux et énumérer les bases de données auxquelles s'est rapporté le chercheur pour en arriver à la conclusion qu'il n'existe pas d'alternatives possibles à l'utilisation des animaux.

Le mot « alternatives » est rentré dans l'usage après la publication en 1978 par David Smyth, physiologiste et alors Président de la UK Research Defence Society, du livre Alternatives to Animal Experiments. Dans ce livre, Smyth donne une définition des alternatives reposant sur le principe des Trois R, à savoir : « Toute procédure qui permet de remplacer tous les animaux d'expérimentation, de réduire les nombres d'animaux nécessaires, ou d'amoindrir la douleur ou le stress dont souffriraient les animaux en satisfaisant aux besoins essentiels de l'être humain et d'autres animaux [Trad.] ». Bien que plusieurs tentatives ont été faites de limiter le sens de « alternatives » au seul Remplacement, c'est dans le contexte plus large de sa définition première que les alternatives seront ici discutées.

Que signifient les mots « Remplacement », « Réduction » et « Raffinement »?

Tel qu'expliqué, le mot « alternatives » est utilisé pour signifier tout changement à des procédures existantes qui a pour effet le remplacement des animaux, la réduction du nombre d'animaux utilisés ou le raffinement des procédures dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés ou de les remplacer, ou encore réduire la douleur, le stress ou la détresse des animaux.

Le Remplacement signifie, en règle générale, l'utilisation d'un système inanimé à titre d'alternative (ex. : un programme ou modèle informatique, un mannequin). Il peut également s'agir du remplacement des animaux doués de sensations (en général des vertébrés) par des animaux moins sensibles (en général des invertébrés tels que des vers, des bactéries ou autres). Il peut également s'agir de l'utilisation de cultures de cellules et de tissus. Les cellules ont une source, et cette source est souvent animale.

La Réduction signifie l'utilisation de moins d'animaux sans qu'il n'y ait perte d'information utile. Cela peut résulter d'une réduction du nombre de variables grâce à une bonne planification du protocole expérimental, d'une utilisation d'animaux génétiquement homogènes ou d'un contrôle rigoureux des conditions de l'expérience.

Le Raffinement signifie un changement dans au moins un des aspects de l'expérience avec pour effet la réduction du nombre d'animaux ou leur remplacement, ou encore la réduction de toute douleur, détresse ou stress que pourrait vivre les animaux. L'établissement de points limites précoces dans le cas d'études pouvant potentiellement provoquer de la douleur ou de la détresse chez un animal est un exemple de raffinement.

Peu d'alternatives correspondent avec exactitude à l'un ou l'autre des Trois R auquel elles sont rattachées. Par exemple, si la culture de tissus peut permettre que bien des animaux soient remplacés, certains seront encore nécessaires comme sources de cellules. Pour chacun des Trois R, des exemples seront donnés dans les sections ci-dessous sur le Remplacement, la Réduction et le Raffinement.

Répondre du remplacement

Dans cette section, nous traiterons du Remplacement dans le cadre de la recherche, l'enseignement et les tests.

Principes généraux ayant trait au remplacement en recherche et dans les tests

Les cultures cellulaires, les bactéries et les modèles inorganiques ne peuvent permettre d'étudier les processus tels qu'ils se dérouleraient dans un organisme entier et vivant. Ainsi, l'étude réalisée à partir d'une culture de cellules cardiaques ne se compare-t-elle pas à l'étude des cellules in situ, puisque la culture n'offre pas d'indications sur les interactions entre les cellules cardiaques telles qu'elles sont situées dans le coeur entier, ni sur celles avec les systèmes nerveux, endocrinien et immunitaire qui les affectent in vivo. De plus, en culture, les cellules ne sont pas sujettes au débit et à la pression du sang non plus qu'aux nombreux autres facteurs et signaux qui sont le propre d'un organisme entier et vivant.

Les réponses comportementales ne peuvent pas être étudiées à partir de simples cultures de cellules. Le comportement des organismes simples (ex. : bactéries, nématodes) pourrait être étudié, mais toute extrapolation au comportement d'organismes plus complexes serait extrêmement difficile. Dans le même ordre d'idées, il serait impossible d'étudier des phénomènes spécifiques à une espèce ou à un sexe.

Lorsqu'il est nécessaire d'étudier ou d'utiliser isolément des processus particuliers qu'ils soient cellulaires ou moléculaires, les alternatives de remplacement telles que les cultures de cellules/tissus/organes ou cultures bactériennes sont d'excellents outils. Certains facteurs de variabilité – parmi lesquels la lumière, le bruit, les infections latentes pour n'en nommer que quelques uns – compliquent la recherche avec des animaux intacts et sont moindres avec l'utilisation de cultures cellulaires, bactériennes, etc. Il est évident que, dans le cas de l'utilisation d'alternatives inanimées, les variabilités de ce type n'interviennent aucunement.

Lorsque de nouvelles lignées cellulaires sont nécessaires, il devrait être possible de tirer bien plus de cultures et ainsi d'expériences de chaque animal que si l'animal entier était utilisé. De plus, même si les alternatives sont inanimées (ordinateur), il peut rester nécessaire d'utiliser un petit nombre d'animaux pour prélever des données qui seront ensuite traitées sur ordinateur. Ces données doivent être d'excellente qualité, sinon les résultats ne voudront rien dire.

Les systèmes vivants sont reconnus pour leur complexité et leurs comportements inattendus avec l'apparition d'artefacts. Avec un système beaucoup plus simple comme celui de la lignée cellulaire, les artefacts sont bien moindres en autant que les cellules soient conservées dans un milieu adéquat.

En corollaire de ce problème d'artefacts, se distingue la simplicité avec laquelle l'environnement des cellules peut être altéré, ce qui ne pourrait être fait avec un animal intact. Ainsi est-il facile de modifier le pH, la teneur en ions, la concentration d'oxygène ou autre facteur d'un milieu de culture afin d'étudier les effets induits par ces modifications. La reproductibilité de ces études devrait être d'autant plus grande que toutes les variables potentielles sont bien contrôlées.

Le coût des alternatives sera probablement inférieur à celui engendré par l'utilisation d'animaux vivants, même si tel n'est pas toujours le cas. Les coûts liés au matériel informatique, aux logiciels, à l'équipement pour la culture de cellules/tissus/organes, etc., peuvent dépasser les coûts liés à l'achat des animaux.

Le remplacement en recherche

Recherche fondamentale. Les animaux ont grandement été utilisés dans l'étude des principes fondamentaux de la biologie. En général, les chercheurs essaient d'utiliser des animaux dont les processus physiologiques et biochimiques sont similaires à ceux des humains. Nombre de processus fondamentaux sont communs à un large éventail d'organismes, incluant les invertébrés.

Les alternatives. L'utilisation d'animaux d'espèces inférieures, moins sensibles, est considérée comme étant une manière acceptable de remplacer les animaux d'une espèce supérieure destinés à la recherche. Le nématode, Caenorhabditis elegans, est largement utilisé dans l'étude du fonctionnement neuronal de base. Ce nématode est doté d'un système nerveux constitué de 302 neurones ce qui permet raisonnablement d'étudier la fonction de chacun des neurones et leurs interactions entre eux. De même, les généticiens utilisent des drosophiles depuis bien des années.

D'autres alternatives de remplacement ont leur importance en recherche. L'une des plus répandues est le remplacement des méthodes faisant appel à l'utilisation de rongeurs par des méthodes in vitro pour la production d'anticorps monoclonaux.

Le remplacement dans les tests de sécurité et d'efficacité

L'utilisation d'animaux afin de tester la sécurité et l'efficacité de nouveaux produits s'est considérablement accrue dans les quarante dernières années. Les compagnies qui fabriquent ces produits, les agences de réglementation et les consommateurs veulent s'assurer de la sécurité de l'utilisation de ces produits. Si les traitements médicaux comptent pour la plus grande part de ces produits, il demeure que la sécurité de tous les produits que nous utilisons doit être démontrée, y compris les voitures que nous conduisons, les produits d'entretien, les pesticides, les cosmétiques, etc. Il fut un temps où les babouins étaient utilisés dans les tests de collision. Les alternatives, des mannequins instrumentés (pour tests de collision) fournissent de bien meilleures informations que ne le pouvait le modèle animal.

Les préoccupations du public vis-à-vis de la sécurité des produits ont entraîné l'utilisation d'un plus grand nombre de tests, et les préoccupations du public vis-à-vis de la manière dont les animaux sont utilisés dans ces tests de sécurité entraînent maintenant la recherche d'alternatives.

L'un des défis majeurs des promoteurs de méthodologies alternatives pour tester de nouvelles substances a été de prouver que ces méthodologies étaient aussi efficaces que celles devant être remplacées, basées sur l'utilisation d'animaux. Deux organismes créés afin de s'assurer de la validation scientifique appropriée des alternatives à l'utilisation des animaux dans les tests et de leur acceptation subséquente par des agences de réglementation sont le European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) en Italie et le Interagency Coordinating Committee for the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) aux États-Unis.

Si, de par le monde, les agences de réglementation agissent avec prudence en ce qui a trait à l'acceptation de ces alternatives, des progrès continuent d'être faits. En 2002, il existait trois tests in vitro acceptés par les agences de réglementation européennes et trois par les agences de réglementation américaines tandis que plusieurs autres étaient en cours d'évaluation.

Le remplacement en éducation et formation

Formation pratique. L'acquisition des compétences, de la simple technique de la prise de sang aux procédures chirurgicales élaborées comme la laparoscopie, forme une part importante de la formation du personnel vétérinaire et médical, et des animaux sont encore utilisés dans ce cadre. Mais certaines compétences telles les techniques de suture peuvent être apprises sans faire appel à l'utilisation d'animaux. Les placentas rejetés comme déchets peuvent être utilisés pour s'exercer aux techniques de microchirurgie.

Les alternatives. De nos jours, il existe des modèles qui peuvent être utilisés pour s'exercer à faire des procédures. Le rat de Koken, par exemple, permettra à un étudiant de s'exercer à faire une intraveineuse dans la queue avant de la faire sur l'animal vivant. Mannequins et technologies informatiques sont à la disponibilité des chirurgiens pour qu'ils s'exercent à faire des laparoscopies. Les objets inanimés sont mieux acceptés lorsque le toucher et la sensation lors de la formation sont semblables à ceux expérimentés avec des organismes vivants.

Éducation

Les animaux ont été largement utilisés en enseignement et dans le but de montrer les principes biologiques. Les dernières années ont vu une réduction significative du nombre d'animaux utilisés grâce à l'adoption des alternatives.

Les alternatives. Il existe en enseignement un large éventail de possibilités qui permettent de remplacer les animaux. Le matériel audio-visuel et les programmmes informatiques permettent à l'étudiant de visualiser les effets engendrés par la manipulation de divers organes. Nombre de programmes informatisés étant interactifs, l'étudiant peut en quelque sorte participer aux expériences. Par exemple, un programme interactif pour l'anesthésie permet à l'étudiant d'évaluer la profondeur de l'anesthésie, de calculer la dose et choisir la voie d'administration de divers anesthésiques, etc.

Répondre de la réduction

Les recherches documentaires sont vitales afin que les expériences ne soient pas répétées lorsque cela n'est pas nécessaire. La réplication de certaines études est nécessaire afin de vérifier la reproductibilité des résultats obtenus par d'autres chercheurs dans des laboratoires différents. Il n'est cependant pas nécessaire de répéter les mêmes études de très nombreuses fois. Diverses possibilités de réduire le nombre d'animaux nécessaires à l'étude se présentent au chercheur. Il est important de s'assurer que le nombre d'animaux est approprié autant pour le groupe expérimental que pour le groupe témoin. Cela signifie que l'évaluation statistique doit être soigneusement préparée avant que ne commence l'étude. Il peut être utile de consulter un statisticien pour ce faire. Une bonne préparation du plan expérimental avec cueillette de données et analyse appropriées permettront de réduire le nombre d'animaux nécessaires.

Une équipe de recherche bien formée, du chercheur principal aux techniciens de soin des animaux, permettra que toute procédure liée de près ou de loin à l'étude soit normalisée. Il est important que les membres de l'équipe soient formés dans leur spécialité et que de l'expertise additionnelle soit utilisée si nécessaire. Par exemple, s'il s'avère qu'aucun des membres de l'équipe ne sait pratiquer une procédure chirurgicale particulière, un chirurgien ayant cette formation devrait prêter main forte. La formation pertinente à toutes les procédures à effectuer devrait être complétée avant que le projet ne commence.

En ce qui a trait aux laboratoires d'enseignement, le succès des séances de laboratoire est d'autant garanti que ce sont des instructeurs formés qui prépareront les animaux et non les étudiants qui ne le sont pas.

La variabilité qui résulte de conditions expérimentales mal contrôlées peut entraîner l'utilisation de plus d'animaux dans chaque groupe expérimental. Les groupes peuvent êtres réduits en nombre d'animaux, par exemple, dans les cas où une population génétiquement homogène est utilisée, où les animaux ne sont pas sujets à une maladie qui vient compliquer une autre condition, ou alors si les conditions d'hébergement et de soin sont stables. La question de la variabilité est étudiée en détails dans le Module 4 sur la Recherche. Dans ce module, l'influence de divers paramètres (ex. : bruit, lumière, infections, procédures, etc.) sur la précision des résultats expérimentaux est discutée.

Dans une étude, les animaux du groupe témoin peuvent représenter jusqu'à 50 % du nombre total d'animaux. Le chercheur devrait essayer de minimiser ce pourcentage. Utiliser un groupe témoin pour plusieurs tests plutôt qu'un groupe témoin par test, pourrait aider. Si une procédure particulière est répétée dans un laboratoire, un registre des expériences précédentes existera pour cette procédure. Lors d'une étude faisant appel à cette procédure, il peut être possible d'utiliser un très petit nombre d'animaux témoins et de vérifier si les résultats provenant de ces animaux tombent dans les limites précédemment établies, plutôt que d'utiliser de nouveau un groupe témoin complet.

Modèles animaux ciblés. Par le passé, il était difficile de trouver des modèles animaux qui simulaient adéquatement des conditions humaines comme les cancers. Il existait des modèles animaux pour le cancer du sein, mais la cause et le comportement biologique du cancer étaient différents de ceux pour l'être humain. Les traitements appliqués aux modèles animaux ne pouvaient donc pas nécessairement l'être à l'humain.

L'alternative. Le développement d'animaux immunocompromis a permis que des cellules d'origine humaine puissent croître dans des animaux sans avoir recours à l'immunosuppression de l'hôte. Actuellement, le comportement et le traitement de la tumeur dans un modèle animal peuvent refléter la situation chez l'humain. Des modèles animaux aussi ciblés amèneront une réduction globale du nombre d'animaux utilisés à travers une réduction dans la variation liée au modèle et des résultats plus utiles.

Les animaux génétiquement modifiés (GM) (transgéniques, knockouts et mutants) représentent des alternatives prometteuses pour des résultats plus pertinents en ce qui a trait à la compréhension des maladies humaines. Au début, la réduction et le remplacement des animaux seront moindres en raison de la production de colonies souches d'animaux GM, lesquelles nécessitent beaucoup d'animaux. Le raffinement des résultats obtenus avec les animaux GM augure d'importantes avances dans la compréhension et le traitement des maladies humaines ainsi que de l'utilisation de moins d'animaux.

Répondre du raffinement

Le raffinement a été le moins prestigieux des Trois R sans doute parce qu'il produit les changements les moins évidents au niveau des données d'utilisation des animaux, si les nombres sont la statistique la plus importante. Or, le raffinement des techniques a un rôle significatif à jouer autant pour la réduction que pour le remplacement des animaux en recherche, en enseignement et dans les tests. Des techniques raffinées induiront moins de variations et amélioreront les résultats obtenus. Par exemple, l'introduction de nouveaux anesthésiques en même temps qu'une meilleure formation des chercheurs quant à l'utilisation de ces anesthésiques a permis de réduire le nombre de mortalités par anesthésie. Le raffinement des techniques d'analyse statistiques a permis aux chercheurs d'utiliser moins d'animaux sans perte d'information significative.

Le raffinement a son impact le plus important sur la réduction de la douleur et de la détresse des animaux. L'utilisation appropriée d'anesthésiques, d'analgésiques et d'autres mesures à des fins thérapeutiques est très importante dans les études invasives. Le raffinement de l'élevage, en particulier en créant des environnements physiques et sociaux plus complexes, a accru le bien-être des animaux en recherche. L'établissement de points limites scientifiques et appropriés pour diverses études (ex. tests de vaccins) a permis que les animaux aient moins à souffrir tout en n'affectant aucunement la confiance en les résultats.

Il existe nombre d'exemples de raffinements ayant fait une différence autant pour les animaux (minimiser la douleur et la détresse) que pour les résultats des recherches scientifiques.

Élevage. Dans le passé, les animaux d'expérimentation se retrouvaient seuls dans des cages ou des enclos avec très peu de substrats ou d'espace pour pouvoir se comporter normalement. La plupart des animaux d'expérimentation appartiennent à des espèces sociales et l'isolement devient pour eux un facteur de stress.

Les alternatives. La plupart des animaux peuvent être élevés dans des groupes sociaux dans des environnements complexes pour leur permettre de se comporter normalement. Il existe nombres de rapports documentant les effets bénéfiques de ce type d'élevage. Par exemple, les rats qui vivent dans un environnement social et physique complexe développent un cortex cérébral plus épais, comportant plus de connections dendritiques que ceux qui sont gardés en isolation. De jeunes lapins gardés dans de petites cages ont développé des anormalités du squelette, car ils ne pouvaient ni sauter ni courir au moment du développement des muscles et des os.

Les alternatives aux techniques de prélèvement sanguin utilisées dans le passé. Le sinus rétro-orbital de certaines espèces de petite taille (les rongeurs en particulier) était un endroit utile pour prélever d'assez grands échantillons de sang. La procédure avait ses risques (ex : l'œil pouvant être endommagé, particulièrement lors de prélèvements à répétition) et était douloureuse. Plusieurs alternatives ont été développées, incluant le prélèvement de sang à partir de la veine caudale, de la veine saphène et de la veine jugulaire. Même s'il faut avoir des compétences raisonnables pour bien réussir ces procédures, le risque de blesser gravement l'animal est grandement réduit.

Les expériences qui causent une souffrance importante ou la mort. Lors d'études impliquant des tests de vaccins, des maladies infectieuses, des tumeurs, des rejets d'organes ou autre, le point limite choisi pour l'animal a pu, par le passé, être la mort des suites de la maladie. Lorsque la mort d'un animal approche, celui-ci arrête de manger et de boire, se déshydrate facilement. À peu d'exceptions près, la mort peut être prévue à faible échéance à partir du moment où l'animal a cessé de manger et de boire.

Les alternatives. Lorsqu'il est prévu qu'une expérience induise une détresse importante ou la mort, des points limites devraient être établis afin de limiter l'étendue de la détresse et d'anticiper la mort. Autant que faire se peut, des études pilotes devraient être effectuées afin de déterminer le point le plus précoce auquel les résultats scientifiques sont obtenus et auquel l'expérience peut être terminée pour minimiser la détresse des animaux. Au minimum, les études pilotes devraient être utilisées afin de déterminer quels sont les signes cliniques les plus appropriés à la détermination du point limite ou du moment où la mort est inévitable.

Les tests de toxicité. Le test de la DL50 était demandé par les organismes de réglementation pour l'évaluation de la toxicité des nouveaux produits. La dose léthale 50 (DL50) est la dose qui tuera 50 % des animaux. Beaucoup d'animaux ont été utilisés pour déterminer cette dose avec précision même si l'adéquation face à la toxicité humaine n'a pas été établie.

Les alternatives. Un certain nombre de raffinements ont été développés en ce qui a trait aux tests de toxicité et sont acceptés et incorporés dans les lignes directrices de l'OCDE. Pour les tests de toxicité aiguë, la procédure à dose fixe (Tg420), la méthode pour la classe de produits à toxicité aiguë (Tg423) et la procédure « up and down » (Tg425) ont maintenant été acceptées par les pays membres de l'OCDE. Avec l'adoption de ces tests, moins d'animaux sont utilisés et les points limites sont précisés plus tôt dans l'expérience. Le test DL50 (Tg401) a maintenant été retiré et les organismes de réglementation des pays membres de l'OCDE doivent maintenant accepter les données produites avec l'une ou l'autre des trois alternatives énumérées ci-dessus. De plus, des recommandations publiées par ICCVAM décrivent comment utiliser les données d'expériences in vitro pour choisir la dose de départ du test, limitant d'autant mieux les nombres d'animaux nécessaires et améliorant la valeur prédictive des données.

Conclusion

L'utilisation des animaux en recherche, en enseignement et dans les tests n'est pas un droit mais un privilège. Il incombe à chacun des chercheurs de s'assurer qu'il n'y ait pas d'abus des privilèges. Même si les animaux sont, dans la plupart des cas, élevés pour la recherche, cela ne signifie pas qu'il est possible d'en utiliser autant qu'on le souhaiterait et de n'importe quelle manière. Chaque animal est un individu et devrait être traité à ce titre. Nous devons veiller à ce que les animaux ne soient pas sujets à de la douleur ou de la détresse inutile. Que les animaux soient disponibles ne justifient en aucun cas que l'on en utilise un nombre excessif. De plus, aucun animal ne devrait être utilisé s'il existe un modèle également convenable qui permette d'obtenir les mêmes résultats Toute mesure possible doit être prise afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et de prévenir la douleur et la détresse.

C'est en évaluant chacun des protocoles de recherche, d'enseignement ou de tests en ce qui a trait au respect du principe des Trois R que nous remplacerons, réduirons et raffinerons l'utilisation des animaux en science.

Références
  • Base de données Norina
  • The Principles of Humane Experimental Technique W.M.S. Russell et R.L. Burch Methuen & Co. Ltd. London 1959. (Special Edition publ. by Universities Federation for Animal Welfare, 1992)
  • Balls, M., Goldberg, A.M., Fentem, J.H. et al (1995) The three Rs: The way forward: ECVAM Workshop Report 11. ATLA 23: 38-866
  • Rispin, A., Farrar, D., Margosches, E. et al. (2002). Alternative Methods for the Median Lethal Dose (LD50) Test: The Up-And-Down Procedure for Acute Oral Toxicity. ILAR 43(4):233-243.
  • Smyth D. (1978) Alternatives to Animal Experiments 218pp London: Scolar Press